中國醫藥發展基金會

主　　題：	肝硬化的成因與治療
出　　處：	中國醫藥研究叢刊
出版年度：	2002
期　　別：	第廿三期 p.p. 59~p. 65
作　　者：	陳爽 賁長恩
單　　位：	北京中醫藥大學北京100029

 

摘要
　　目的在於觀察體外培養條件下，庫普弗細胞（KC）貯脂細胞（FSC）對肝細胞（PC）基質生成調節效應及PC 增殖及合成功能的影響。採用FSC、KC 和PC 的分離培養，觀察KC 和FSC 對PC 增殖活性和DNA 含量的影響，應用免疫細胞化學和圖像分析系統對PC 中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和纖維粘連蛋白（FN）進行定量分析，以及用液閃法檢測PC 中3H-脯氨酸摻入量。結果證明FSCncm 可明顯促進PC DNA 合成，PC 可合成Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原及FN。FSCncm 可促使雙核的PC 增多，線粒體分裂。提示肝細胞可合成Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原及FN；PC 內可能直接組裝膠原纖維；KCncm、KCtcm、FSCtcm均可上調PC 的基質合成能力。

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關鍵詞
　　肝細胞；庫普弗細胞；貯脂細胞；細胞培養；細胞外基質近年來，電鏡免疫組化、生物化學及分子生物學的研究均已證明，生理或病理條件下，在體內或離體PC 均能合成膠原和FN。但有關PC 合成膠原的類型及PC 與纖維化發生過程中細胞外基質過度沈積的關係仍存有爭議。對其影響基質合成的因素研究頗少，在體外條件下，觀察KC、FSC對PC 基質生成的調節效應尚未見報導。本文僅就KC 和FSC 對PC 增殖及合成功能的影響進行實驗研究。

　　1.材料和方法
　　　1.1 動物與試劑
　　　　雄性Wistar 大鼠，體重140～160g，購自中國醫學科學院實驗動物中心，以CCl4 與橄欖油等量混合，皮下一次注射（150μl/g 體重）4d 後用於實驗。試劑全部為Sigma 公司；ABC 試劑盒、兔抗鼠二抗、豬抗兔二抗為DAKO 公司；3H-脯氨酸購自中國原子能科學研究所(1)。
　　　1.2 PC 分離與培養
　　　　依據Seglen(2 ) ?消化法分離培養PC。台盼藍染色檢測正常和CCl4 損傷PC 活率分別為（90±5）%及（80±5）%。收獲細胞數為20×107 細胞／肝，純度分別為（95±6）%及（90±5）%。細胞懸液濃度調整到3.75×105 細胞／ml，接種培養，提取細胞培養液(1)。對照組以不含血清的MEM培養，各實驗組分別換用1:4 稀釋度（條件培養液：MEM）培養24h 後取樣檢測，實驗分組見表1。
　　　1.3 KC 分離和培養
　　　　按Friedman 方法(3.4)進行前灌流，離散細胞，將細胞懸液於37℃振盪水浴30min，以200 目雙層尼龍網過濾後，450r/min，離心6min。再用清洗液重離心二次，用DMEM（含10%小牛血清）培養液重懸細胞，細胞活率為（85±5）%，正常和CCl4 損傷大鼠獲得細胞分別為70×106～125×106 和140×106～190×106 細胞／肝，接種40min 後，用DMEM 洗三次以除去FSC，然後換不含血清的DMEM 培養24h。以過氧化物?染色顯示細胞純度可達90%以上(1)。
　　　1.4 FSC 分離和培養
　　　　選用400～500g 體重大鼠。按Friedman 法( 3,4 )分離，細胞純度為90±5，活率達95%以上。獲細胞量為1×107 個／肝，調整密度至0.2×106細胞／ml，分別接種培養，24h 更換培養基，進行各項指標測定。
　　　1.5 條件培養基的制備
　　　　KC 條件培養基（KCcm）液的制備在指定時間提取KC 培養液，4℃下450r/min，離心30min，棄去沈澱，0.22μm 微孔膜濾過，分裝後於-40℃保存。FSC 條件培養基（FSCcm）的制備由正常大鼠分離FSC，培養48h後，換用含0.5%胎牛血清培養液培養，每隔48h 換液，分別於第一次換液後24h 和144h 提取細胞培養液，450r/min，離心30min（4℃），棄去沈澱，0.22μm 微孔膜過濾，分裝後於-40℃保存。
　　　1.6 透射電鏡樣本的製備
　　　　按常規進行(1 )。
　　　1.7 PC 增殖活性的檢測
　　　　採用流式細胞儀分析細胞內DNA 含量。
　　　1.8 PC 中ECM 合成的分析
　　　　採用免疫細胞化學及圖像分析系統，分別對PC 中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原
和FN 含量採用TN-8502（美國）圖像分析儀進行定性定量分析及液閃法檢測PC 中3H-脯氨酸摻入量(1 )。

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　　　2.1 細胞活率及生長狀況
　　　　Seglen 法分離PC，輔以等密度Percoll 離心法加以純化，獲細胞純度和活率均達90%以上。倒置顯微鏡觀察，則分離的細胞呈球形；培養3-4h後細胞貼壁，三五成群分布；24h 後細胞排列成索狀或相連成片，細胞形態呈不規則的多邊形，多見雙核。
　　　2.2 電鏡觀察
　　　　正常對照組（圖1），而KCtcm 組其胞質內可見散在分布，走向無序的“膠原原纖維”結構。細胞核變形，核周隙明顯增寬、糖原顆粒顯著減少，粗面內質網擴張，可見成束的膠原原纖維（圖2、3）。
　　　　FSCncm 組與對照組相比，可見發育良好的高爾基複合體、線粒體及內質網。核形態無異常，可見中心粒及分裂的線粒體，較多的自噬體（圖4）而FSCtcm 組核形態正常，粗、滑面內質網明顯增多，並有擴張，胞質內可見散在、成束無序的“膠原原纖維”。
　　　2.3 PC 內DNA 定量分析
　　　　PC 培養4h 後，各實驗組分別換用稀釋度為1:4 條件培養基培養，24h收集細胞，以流式細胞儀進行DNA 含量檢測。與對照組相比，KCncm、KCtcm、FSCtcm 組PC 中DNA 含量均有所降低，下降率分別為27%、44%、30%。而FSCncm 的DNA 量顯著增高，是對照組的2-3 倍。
　　　2.4 PC 內膠原蛋白的測定
　　　　PC 培養4h 後，各實驗組換用1:4 稀釋度的培養液培養24h 後收集細胞，檢測PC 內3H-脯氨酸摻入量。KCncm、KCtcm、FSCncm 組內3H-脯氨酸摻入量均有所升高，分別為對照組的1.2、1.4、1.6 倍，而FSCtcm 組則下降（表2）。
　　　　2.5 以稀釋度為1:4 條件培養基培養PC24h 後，取出蓋片，用ABC 免疫法檢測PC 內Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和FN（表3）。
　　　　Ⅰ型膠原對照組反應較弱，胞質中含淡棕色反應顆粒，多位於核周。KCncm、KCtcm、FSCtcm 組陽性反應增強，KCtcm 組最為明顯，呈棕褐色反應顆粒，FSCncm 無明顯變化（表3）
　　　　Ⅲ型膠原其反應顆粒呈棕褐色，與對照組相比，KCtcm、FSCtcm 組陽性反應最強，KCncm 次之，FSCncm 組與對照組相似（表3）。
　　　　Ⅳ型膠原各組PC 內Ⅳ型膠原均呈陽性，但較Ⅰ、Ⅲ膠原反應較弱，反應顆粒呈淡棕色。KCncm、KCtcm、FSCtcm 組陽性反應增強，而FSCncm含量較對照組略有降低（表3）。
　　　　FN PC 內含有豐富的FN，反應顆粒呈棕褐色，分布於核周，與對照組相比，　KCncm、KCtcm、FSCtcm 其反應強度明顯增高，而FSCncm 組則無變化（表3）。