| 出 處： | 中國醫藥研究叢刊 |
| 出版年別： | 2002 |
| 期 別： | 第廿三期 p.p. 51~58 |
| 作 者： | 賁長恩 |
| 單 位： | 北京中醫藥大學北京100029 |
PC 和KC 在貯脂細胞激活過程中的協同作用
PC 和KC 在貯脂細胞激活過程中的協同作用
摘要
近年來，對人和實驗性肝纖維化發病機理的研究焦點主要集中於貯脂細胞（FSC）的病理學改變，而有關正常或不完全損傷肝實質細胞（PC）在FSC 激活過程中的作用少見報導。本文對正常CCl4 損傷大鼠PC 進行分離培養，觀察PC 和庫普弗細胞（KC）在FSC 激活過程中的協同作用。採用PC、KC 和FSC 分離培養，用流式細胞儀測定DNA 含量，免疫組化和圖像分析對FSC 中Ι、Ⅲ、Ⅳ型膠原和FN 進行定量分析，液閃法檢測FSC中3H-脯氨酸摻入量。來自正常或CCl4 損傷大鼠PC 條件培養基（PCncm、PCtcm）對原代培養FSC 的增殖具有較強的刺激效應，FSC 內3H-脯氨酸摻入量呈現時間和劑量相關性地升高，DNA 含量在時間和劑量上也呈正相關的增加。單獨用PCncm 或PCncm+PCtcm 合用時，FSC 表現出明顯地轉化特徵，而FSC 內Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和纖維粘連蛋白（FN）均顯著升高。PC和KC 對FSC 的激活具有協同效應，並呈現時空相關性，對FSC 內ECM 合成的協同效應與增加細胞總量及增加單個FSC 合成ECM 的能力有關。
近年來，對人和實驗性肝纖維化發病機理的研究焦點主要集中於貯脂細胞（FSC）的病理學改變，而有關正常或不完全損傷肝實質細胞（PC）在FSC 激活過程中的作用少見報導。本文對正常CCl4 損傷大鼠PC 進行分離培養，觀察PC 和庫普弗細胞（KC）在FSC 激活過程中的協同作用。採用PC、KC 和FSC 分離培養，用流式細胞儀測定DNA 含量，免疫組化和圖像分析對FSC 中Ι、Ⅲ、Ⅳ型膠原和FN 進行定量分析，液閃法檢測FSC中3H-脯氨酸摻入量。來自正常或CCl4 損傷大鼠PC 條件培養基（PCncm、PCtcm）對原代培養FSC 的增殖具有較強的刺激效應，FSC 內3H-脯氨酸摻入量呈現時間和劑量相關性地升高，DNA 含量在時間和劑量上也呈正相關的增加。單獨用PCncm 或PCncm+PCtcm 合用時，FSC 表現出明顯地轉化特徵，而FSC 內Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和纖維粘連蛋白（FN）均顯著升高。PC和KC 對FSC 的激活具有協同效應，並呈現時空相關性，對FSC 內ECM 合成的協同效應與增加細胞總量及增加單個FSC 合成ECM 的能力有關。
關鍵詞
肝細胞；庫普弗細胞；貯脂細胞；膠原；纖維粘連蛋白；條件培養基；圖像分析目前，有關PC 和KC 在FSC 激活過程中的作用機制及有關正常或不完全損傷PC 在FSC 激活過程中的有關報導，在國內外尚屬少見。本實驗採用免疫組織化學、超微結構、3H-脯氨酸摻入對DNA 含量測定等方法對正常或CCl4 損傷大鼠的KCncm、PCncm、PCtcm 及兩組複加原代培養FSC 的增殖效應進行了實驗研究。觀察PC 與KC 條件培養基對培養FX 激活的聯合作用。
肝細胞；庫普弗細胞；貯脂細胞；膠原；纖維粘連蛋白；條件培養基；圖像分析目前，有關PC 和KC 在FSC 激活過程中的作用機制及有關正常或不完全損傷PC 在FSC 激活過程中的有關報導，在國內外尚屬少見。本實驗採用免疫組織化學、超微結構、3H-脯氨酸摻入對DNA 含量測定等方法對正常或CCl4 損傷大鼠的KCncm、PCncm、PCtcm 及兩組複加原代培養FSC 的增殖效應進行了實驗研究。觀察PC 與KC 條件培養基對培養FX 激活的聯合作用。
1.材料與方法
1.1 動物與試劑
應用雄性Wistar 大鼠，體重140-180g，以CCl4 與橄欖油等量混合，皮下注射一次（150μl/g 體重）4d 後用於實驗。試劑全部為Sigma 公司；ABC 試劑盒、兔抗鼠二抗、豬抗兔二抗為DAKO 公司；3H-脯氨酸購自中國原子能科學研究所(1 )。
1.2 KC 的分離與培養
按Friedman 方法( 2,3 )進行前灌流，離散細胞，將細胞懸液於37℃振蕩水溶20min，以200 目雙層尼龍網過濾後，450r/min，離心6min。再用清洗液重懸細胞，重複離心二次，用DMEM（含10%小牛血清）培養液重懸細胞，其細胞活率為85±5%，正常和CCl4 損傷大鼠獲得的細胞分別為70～125×106 和140～190×106 細胞／肝。接種40min 後，用DMEM 洗三次以除去FSC，然後換不含血清的DMEM 培養液，培養24h，以過氧化物染色顯示細胞純度可達90%以上(1 )。
1.3 PC 的培養分離和培養
依據Seglen(4 ) ?消化法分離培養PC。台盼藍染色鑒定正常和CCl4 損傷PC 活率分別為90±5%及80±5%，收獲細胞數為20×107 細胞／肝，純度分別為95±6%及90±5%。細胞懸液濃度調整到375×105 細胞／ml 接種培養，提取細胞培養液(1)。
1.4 FSC 分離和培養
選用400～500g 體重大鼠，按Friedman 法( 2,3 )分離，細胞純度為90±5%，活率達95%以上，獲細胞量為1×107 個／肝，調整密度至0.2×106細胞／ml，分別接種培養，24h 更換培養液，在預定時間進行各項指標測定(1 )（表1）。
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1.5 條件培養基的制備
在規定時提取KC 培養液，4℃下450r/min，離心30min，棄去沈澱，0.22μm 微孔膜濾過，分裝後於-40℃保存(1)。
1.6 FSC 增殖活性的檢測
倒置顯微鏡和電鏡觀察其特殊的外形，顯微分光光度計（波長380nm）觀察VitA 自發熒光，免疫組化ABC 法顯示細胞內結蛋白(1 )。
1.7 FSC 膠原蛋白合成總量的測定
每孔加入3H-脯氨酸1μci/ml，培養48h 後棄除培養液，加入0.25%胰? 90μl，倒置顯微鏡下觀察，細胞變圓後加入10μl 小牛血清，吹打細胞至脫壁，49 型玻璃纖維濾紙收集細胞，Beckman LS5810 型液體閃爍計數儀檢測(1 )。
1.8 FSC 中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和FN 檢測分析
從培養板中取出蓋片，0.01M PBS（pH7.4）沖洗三次，10%中性福爾馬林固定5min，PB 沖洗三次，1%過氧化氫處理去內源性過氧化氫。10%小牛血清孵育封閉非特異性反應，分別加一抗（抗Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和FN），於4℃冰箱孵育過夜，PBS 沖洗，DAB 顯色，沖洗，甘油明膠封片，反應產物為棕褐色，省去一抗作為陰性對照(1)。圖像分析儀進行定量分析。
1.9 FSC 中DNA 含量測定
採用流式細胞儀分析細胞內DNA 含量。
1.1 動物與試劑
應用雄性Wistar 大鼠，體重140-180g，以CCl4 與橄欖油等量混合，皮下注射一次（150μl/g 體重）4d 後用於實驗。試劑全部為Sigma 公司；ABC 試劑盒、兔抗鼠二抗、豬抗兔二抗為DAKO 公司；3H-脯氨酸購自中國原子能科學研究所(1 )。
1.2 KC 的分離與培養
按Friedman 方法( 2,3 )進行前灌流，離散細胞，將細胞懸液於37℃振蕩水溶20min，以200 目雙層尼龍網過濾後，450r/min，離心6min。再用清洗液重懸細胞，重複離心二次，用DMEM（含10%小牛血清）培養液重懸細胞，其細胞活率為85±5%，正常和CCl4 損傷大鼠獲得的細胞分別為70～125×106 和140～190×106 細胞／肝。接種40min 後，用DMEM 洗三次以除去FSC，然後換不含血清的DMEM 培養液，培養24h，以過氧化物染色顯示細胞純度可達90%以上(1 )。
1.3 PC 的培養分離和培養
依據Seglen(4 ) ?消化法分離培養PC。台盼藍染色鑒定正常和CCl4 損傷PC 活率分別為90±5%及80±5%，收獲細胞數為20×107 細胞／肝，純度分別為95±6%及90±5%。細胞懸液濃度調整到375×105 細胞／ml 接種培養，提取細胞培養液(1)。
1.4 FSC 分離和培養
選用400～500g 體重大鼠，按Friedman 法( 2,3 )分離，細胞純度為90±5%，活率達95%以上，獲細胞量為1×107 個／肝，調整密度至0.2×106細胞／ml，分別接種培養，24h 更換培養液，在預定時間進行各項指標測定(1 )（表1）。
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1.5 條件培養基的制備
在規定時提取KC 培養液，4℃下450r/min，離心30min，棄去沈澱，0.22μm 微孔膜濾過，分裝後於-40℃保存(1)。
1.6 FSC 增殖活性的檢測
倒置顯微鏡和電鏡觀察其特殊的外形，顯微分光光度計（波長380nm）觀察VitA 自發熒光，免疫組化ABC 法顯示細胞內結蛋白(1 )。
1.7 FSC 膠原蛋白合成總量的測定
每孔加入3H-脯氨酸1μci/ml，培養48h 後棄除培養液，加入0.25%胰? 90μl，倒置顯微鏡下觀察，細胞變圓後加入10μl 小牛血清，吹打細胞至脫壁，49 型玻璃纖維濾紙收集細胞，Beckman LS5810 型液體閃爍計數儀檢測(1 )。
1.8 FSC 中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和FN 檢測分析
從培養板中取出蓋片，0.01M PBS（pH7.4）沖洗三次，10%中性福爾馬林固定5min，PB 沖洗三次，1%過氧化氫處理去內源性過氧化氫。10%小牛血清孵育封閉非特異性反應，分別加一抗（抗Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和FN），於4℃冰箱孵育過夜，PBS 沖洗，DAB 顯色，沖洗，甘油明膠封片，反應產物為棕褐色，省去一抗作為陰性對照(1)。圖像分析儀進行定量分析。
1.9 FSC 中DNA 含量測定
採用流式細胞儀分析細胞內DNA 含量。
2.結果
2.1 條件培養基對原代培養FSC 表型轉化的影響
培養第8d（稀釋度為1:4）時，用ABC 法染色，FSC 呈現結蛋白陽性反應。PCncm 、PCtcm 組細胞明顯增多， 結蛋白陽性反應較強。而KCncm+PCncm、KCncm+PCtcm 組，除細胞明顯增多外，結蛋白陽性反應均增強，電鏡觀察PCncm、PCtcm 組，FSC 的超微結構與對照組相比無明顯變化；而KCncm 組細胞則有明顯的表型轉化特徵；KCncm+PCncm 組其表型轉化特徵更為明顯，如高爾基複合體明顯肥大、增多，囊腔擴大，大小泡也增多，內質網增多並擴張，沿胞膜可見平行排列的微絲束。
2.2 在不同稀釋度的KCncm、PCncm 作用下，對原代培養FSC DNA
含量呈劑量關係性增加（表2）。
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表2 表明稀釋度在1:4 時刺激效應最強，KCncm、PCncm 與對照組相比DNA 含量分別增加了2.1 倍和1.6 倍。而KCncm、PCncm 合用時DNA 含量較對照組升高了4.5 倍，當稀釋為1:8 時，其刺激作用最強，並呈現時間相關性（表3）。培養4d，各組DNA 含量即明顯增強，KCncm、PCncm分別為對照組的2.0 和1.9 倍；8d 時分別為對照組的3.1 倍和2.6 倍；KCncm+PCncm 時FSC 內DNA 含量4d 即是對照組3.3 倍，8d 時則為4.5 倍和1.5 倍。各組按照序相比均有統計學意義。
PCtcm 可上調FSC 的增殖活性，而FSC 應答PCtcm 的促有絲分裂效應也具有明顯的劑量和時間相關性（表2、3），KCncm+PCtcm 合用時，其刺激效應幾乎是相加的結果（表2、3）。
2.3 在不同稀釋度條件培養基對原代培養FSC 內3H-脯氨酸摻入量也呈劑量相關性增加(表3)。
從表2 可看出，FSC 內3H-脯氨酸滲入量隨劑量增加而增加，稀釋度為1:4 時，刺激效應最強，與對照組相比KCncm 組升高3.7 倍、PCncm 組升高2.0 倍、PCtcm 組升高1.9 倍；而KCncm+PCncm 和KCncm+PCtcm 組其氚的最大摻入量分別是對照組的5.0 倍和4.9 倍（表2）；8d>6d>4d，KCncm、PCncm、PCtcm 組8d 時分別是對照組的3.7 倍、2.0 倍、1.9 倍。而氚摻入量也呈現時間相關性（表3）。而KCncm+PCncm 其摻入量增加更為明顯。與對照組相比4d 升高4.8 倍、6d 升高5.8 倍、8d 升高5.0 倍，均有統計學意義。
2.4 各組FSC 胞質內含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原及FN 呈棕褐色陽性顆粒，多分布於核周，胞質內陽性顆粒較少，對照組呈淡棕黃色的弱陽笥。圖像分析表明，PCncm、PCtcm 其各種含量略有增加，而KCncm+PCncm 合用時，可使Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原與FN 含量明顯增多，分別達對照組的2.6、、2.5、3.6 倍（KCncm+PCncm）及2.5、2.4、2.7、3.9 倍（KCncm+PCncm）（表4）
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2.1 條件培養基對原代培養FSC 表型轉化的影響
培養第8d（稀釋度為1:4）時，用ABC 法染色，FSC 呈現結蛋白陽性反應。PCncm 、PCtcm 組細胞明顯增多， 結蛋白陽性反應較強。而KCncm+PCncm、KCncm+PCtcm 組，除細胞明顯增多外，結蛋白陽性反應均增強，電鏡觀察PCncm、PCtcm 組，FSC 的超微結構與對照組相比無明顯變化；而KCncm 組細胞則有明顯的表型轉化特徵；KCncm+PCncm 組其表型轉化特徵更為明顯，如高爾基複合體明顯肥大、增多，囊腔擴大，大小泡也增多，內質網增多並擴張，沿胞膜可見平行排列的微絲束。
2.2 在不同稀釋度的KCncm、PCncm 作用下，對原代培養FSC DNA
含量呈劑量關係性增加（表2）。
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表2 表明稀釋度在1:4 時刺激效應最強，KCncm、PCncm 與對照組相比DNA 含量分別增加了2.1 倍和1.6 倍。而KCncm、PCncm 合用時DNA 含量較對照組升高了4.5 倍，當稀釋為1:8 時，其刺激作用最強，並呈現時間相關性（表3）。培養4d，各組DNA 含量即明顯增強，KCncm、PCncm分別為對照組的2.0 和1.9 倍；8d 時分別為對照組的3.1 倍和2.6 倍；KCncm+PCncm 時FSC 內DNA 含量4d 即是對照組3.3 倍，8d 時則為4.5 倍和1.5 倍。各組按照序相比均有統計學意義。
PCtcm 可上調FSC 的增殖活性，而FSC 應答PCtcm 的促有絲分裂效應也具有明顯的劑量和時間相關性（表2、3），KCncm+PCtcm 合用時，其刺激效應幾乎是相加的結果（表2、3）。
2.3 在不同稀釋度條件培養基對原代培養FSC 內3H-脯氨酸摻入量也呈劑量相關性增加(表3)。
從表2 可看出，FSC 內3H-脯氨酸滲入量隨劑量增加而增加，稀釋度為1:4 時，刺激效應最強，與對照組相比KCncm 組升高3.7 倍、PCncm 組升高2.0 倍、PCtcm 組升高1.9 倍；而KCncm+PCncm 和KCncm+PCtcm 組其氚的最大摻入量分別是對照組的5.0 倍和4.9 倍（表2）；8d>6d>4d，KCncm、PCncm、PCtcm 組8d 時分別是對照組的3.7 倍、2.0 倍、1.9 倍。而氚摻入量也呈現時間相關性（表3）。而KCncm+PCncm 其摻入量增加更為明顯。與對照組相比4d 升高4.8 倍、6d 升高5.8 倍、8d 升高5.0 倍，均有統計學意義。
2.4 各組FSC 胞質內含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原及FN 呈棕褐色陽性顆粒，多分布於核周，胞質內陽性顆粒較少，對照組呈淡棕黃色的弱陽笥。圖像分析表明，PCncm、PCtcm 其各種含量略有增加，而KCncm+PCncm 合用時，可使Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原與FN 含量明顯增多，分別達對照組的2.6、、2.5、3.6 倍（KCncm+PCncm）及2.5、2.4、2.7、3.9 倍（KCncm+PCncm）（表4）
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3.討論
本項研究總體是利用原代培養大鼠PC 和FSC 系統為模型觀察肝臟細胞調節網絡及柴胡皂干預作用的體外實驗觀察研究。有關KC 對原代培養FSC 激活的調節作用一文中已證明，KC 在FSC 激活的過程中起重要作用，被激活的FSC 可能是慢性肝損傷對ECM 過度沈積的主要細胞來源(1)。本文結果表明，正常大鼠分離的PC 條件培養基可刺激原代培養FSC 的增強，效應的強弱與條件培養基的濃度及作用時間呈正相關（表2）。而CCl4損傷PC 條件培養基也具有較強的促進有絲分裂活動。我們認為PCcm（條件培養基）中的PC 衍生因子可能不是PC 重新合成的產物，可能是已合成的因子，貯存於“細胞池”內。當損傷發生時，該因子通過破損的細胞膜釋放到細胞外，作用於鄰近的FSC，並促進其增殖(5 ,6)。這可能是通過旁分泌機制激活了FSC，液閃檢測表明PCncm、PCtcm 組FSC 內3H-脯氨酸摻入量呈時間和劑量相關性升高（表2），並與各組DNA 含量的增加成比例，同時也證明，單個FSC 內Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原的含量並無明顯增多（表4）。提示PCcm 對FSC 內膠原合成的上調作用，主要是由於加速了FSC 增殖，使細胞數量增多，進而導致各組膠原蛋白合成總量升高。可見正常和CCl4損傷大鼠PC 均可產生某種可溶性因子，上調FSC 的增殖活性，纖維化是一種動態級聯反應，在其發生過程中PC 與間質細胞及其它非實質細胞間可能存在著相互作用(7 )。據此本文就以PCncm、KCncm 觀察其對FSC 的聯合作用。結果表明，來自PCncm、KCncm 對FSC 的增殖具有較強的刺激效應，效應強弱與條件培養基的濃度及作用時間呈正相關。在PCncm、KCncm作用下，FSC 內3H-脯氨酸摻入量呈時間和劑量相關性升高，這種升高與各組DNA 含量的增加成比例，而單個FSC 內Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原及FN 的含量無明顯增多。當PCncm 或PCncm+KCncm 合用時，FSC 表現出明顯的轉化特徵，DNA 合成、3H-脯氨酸摻入量及單個FSC 內Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原及FN的含量均顯著升高。
綜上所述，實驗證實了PC 可產生某種或某些促有絲分裂因子上調FSC的增殖活性，並對PC 在FSC 激活過程中的調節作用及其作用機制提出如下幾點看法：(1)PC 和KC 對FSC 的激活具有協同效應；(2)PC 和KC 對FSC內ECM 合成的協同刺激效應與增加細胞總量及增強單個FSC 合成ECM 的能力有關；(3) PC 與KC 可能協同並呈時空相關性序列激活FSC。本文是肝細胞間調節網絡及柴胡皂干預作用的體外研究的一部份
本項研究總體是利用原代培養大鼠PC 和FSC 系統為模型觀察肝臟細胞調節網絡及柴胡皂干預作用的體外實驗觀察研究。有關KC 對原代培養FSC 激活的調節作用一文中已證明，KC 在FSC 激活的過程中起重要作用，被激活的FSC 可能是慢性肝損傷對ECM 過度沈積的主要細胞來源(1)。本文結果表明，正常大鼠分離的PC 條件培養基可刺激原代培養FSC 的增強，效應的強弱與條件培養基的濃度及作用時間呈正相關（表2）。而CCl4損傷PC 條件培養基也具有較強的促進有絲分裂活動。我們認為PCcm（條件培養基）中的PC 衍生因子可能不是PC 重新合成的產物，可能是已合成的因子，貯存於“細胞池”內。當損傷發生時，該因子通過破損的細胞膜釋放到細胞外，作用於鄰近的FSC，並促進其增殖(5 ,6)。這可能是通過旁分泌機制激活了FSC，液閃檢測表明PCncm、PCtcm 組FSC 內3H-脯氨酸摻入量呈時間和劑量相關性升高（表2），並與各組DNA 含量的增加成比例，同時也證明，單個FSC 內Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原的含量並無明顯增多（表4）。提示PCcm 對FSC 內膠原合成的上調作用，主要是由於加速了FSC 增殖，使細胞數量增多，進而導致各組膠原蛋白合成總量升高。可見正常和CCl4損傷大鼠PC 均可產生某種可溶性因子，上調FSC 的增殖活性，纖維化是一種動態級聯反應，在其發生過程中PC 與間質細胞及其它非實質細胞間可能存在著相互作用(7 )。據此本文就以PCncm、KCncm 觀察其對FSC 的聯合作用。結果表明，來自PCncm、KCncm 對FSC 的增殖具有較強的刺激效應，效應強弱與條件培養基的濃度及作用時間呈正相關。在PCncm、KCncm作用下，FSC 內3H-脯氨酸摻入量呈時間和劑量相關性升高，這種升高與各組DNA 含量的增加成比例，而單個FSC 內Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原及FN 的含量無明顯增多。當PCncm 或PCncm+KCncm 合用時，FSC 表現出明顯的轉化特徵，DNA 合成、3H-脯氨酸摻入量及單個FSC 內Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原及FN的含量均顯著升高。
綜上所述，實驗證實了PC 可產生某種或某些促有絲分裂因子上調FSC的增殖活性，並對PC 在FSC 激活過程中的調節作用及其作用機制提出如下幾點看法：(1)PC 和KC 對FSC 的激活具有協同效應；(2)PC 和KC 對FSC內ECM 合成的協同刺激效應與增加細胞總量及增強單個FSC 合成ECM 的能力有關；(3) PC 與KC 可能協同並呈時空相關性序列激活FSC。本文是肝細胞間調節網絡及柴胡皂干預作用的體外研究的一部份